Thèmes: Trangénèse, plasmides, bioluminescence, sélection de bactéries, résistances aux antibiotiques, ß-lactamase, formation de colonies sur boîtes de pétri. Allumer le transformateur et faire migrer à 100V (ampérage maximum). Transformation bactérienne Protocole expérimental Chaque groupe d'élèves dispose d'une "culture-mère" de E.coli sensible à l'ampicilline, de 4 boîtes de pétri à ensemencer préparées avec une gélose nutritive LB, dont 2 contenant de l'ampicilline et une de l'ampicilline et de l'arabinose. Il peut varier largement selon les groupes bactériens. Chaque groupe d'élèves dispose d'une "culture-mère" de E.coli sensible à l'ampicilline, de 4 boîtes de pétri à ensemencer préparées avec une gélose nutritive LB (+ IPTG), dont 3 contenant de l'ampicilline. La transgénèse est l’addition d’un ou de plusieurs gènes étrangers dans une cellule. Visualiser la transformation de bactéries Matériel nécessaire : - Kit pGLO de Transgénèse Bactérienne (Bio-Rad) : le gène de la GFP est inséré dans un plasmide conférant la résistance à l'ampicilline, et sous la dépendance Pour effectuer des transformations biologiques en routine, il est nécessaire d’avoir une méthode de transformation très efficace. Organisation Le matériel génétique des Procaryotes est généralement constitué que d’ une seule molécule d’ADN double-brin et circulaire * (figure 1).Sa longueur est de l’ordre du mm (1,3 mm chez E. coli) : le Préparer le mélange de réactif PCR juste avant l'emploi. La transfection est une technique de biologie moléculaire qui consiste à introduire un ADN étranger dans une cellule eucaryote cultivée in vitro. Le clonage moléculaire nécessite des enzymes de restrictions capables de couper l’ADN , et de l’ADN ligase capable de recoller les fragments d’ADN. Les gènes luxC, luxD et luxE codent pour des protéines impliquées dans la conversion d’acides gras en une longue chaîne d’aldéhyde nécessaire à la réaction de luminescence. Replacer les tubes dans la glace pendant 5 minutes. Chapitre n°5 Chapitre n°5 : génétique bactérienne: génétique bactérienne: génétique bactérienne 1. En génétique, une transformation génétique est l'intégration d'un fragment d'ADN étranger dans une cellule, ce qui peut entraîner une modification héréditaire du phénotype de l'organisme receveur. Fast induction does not work for all proteins and can give you suboptimal yields. Centrifuger le reste de la suspension 30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les cellules. bactérienne possédant une mutation dans le gène LacZ. Laisser refroidir le gel quelques instants. transformation avec l'insert. Transformation is the process by which foreign DNA is introduced into a cell. Transfusion de plaquettes : produits, indications HAS / Service des bonnes pratiques professionnelles / Octobre 2015 6 Préambule Contexte d’élaboration de la recommandation de bonne pratique Le dernier document de recommandations sur les indications des transfusions de plaquettes date Structure et fonctions du génome bactérien 1.1. Slow induction can enhance the solubility of some proteins. La bioluminescence: La luciférase bactérienne est une enzyme contenant 2 sous-unités (α et ß) codées respectivement par les gènes luxA et luxB. Xq���` `F3rl�#^�΁��f�h4�$o�K�g�Q>�RU��nJ�p ��$�Y]]���U�dW?������1~���>�d����4����ݜ�~x��j!��)�؇��7�q�O0��4�Y�yZ�������=�߾�����훏ɇ�$K�����o�܃8酔w��o�a�,?O�*Y?Mt��rhfȴH��6,���3XL\��}�2�2��fr�|yQ�&-O��HEi�� �>�&�,abȲ�����.��к�\���萔���^�M�L���m���Jا|H7��%͞��ˉ��3�� ���c�b�m���ۉI��դH2��K����n�@�/���6�c�I ����G@�qS� *��w�+�d=�]-䙵*]�JDk���f���J�2-Ul����X���XZ5�U�_笁ϖ։V���U�K���ꏏͦ�{;���)�'��C�:gfe*�h�M�lR����}�H� }�@ r�����L_���A��ƒ�@O�����#�\?���[������G@��qn�U�Jj� ^�@tѳ�N�y*�h���s�|�=�d*��'� �_�I ���H�c%���-�b�'�\�,��������e�;�t�_��h,wa0 ��B���kd���kv�H �;����@�� ޺1��}�*0�?��0J�O,��Bq��4��p�ׂ�Æ���#�{��j� �s3�!rd�H�Ew�#ݩ�|�VT��X��� �@n��츴��6;���A�1_�!d,h��%xuW?tXb�"g�3���+��L��O�����?�@T�Z���q��O8S���3���� m��ѡ�N3岞u{ ��JPѦ�t�}�i���w�1�ť�RF���4P{���y0+q�qOR��1Y׉X���w�i��R4%u����dK)��U. Un passage à 42°C restaure la fluidité des membranes permettant l’incorporation de l’ADN. Génétique Microbienne 4 Figure 5 a : Elect opho èse d’ADN bactéien su gel d’agaose. Eventuellement en le mettant au frigo. Incuber les tubes deux minutes à 42°C (choc thermique). La ligase a été isolée pour la première fois à partir du bactériophage T4. La transformation dépendra du type de bactéries compétentes dont vous disposez. Après environ 3 heures, vérifier la densité optique de la culture. L’aptitude à la transformation. L’intensité du signal sera ainsi plus forte. BiOutils: l’interface de l’Université de Genève pour soutenir l'enseignement des Sciences de la Vie. Cette expérience a été initialement mise en place par C. Béguin et M. Goldschmidt-Clermont. Faire de même avec les plasmides stockés à – 20 °C. Ressources Scolaire SVT Schéma SVT tous niveaux La Transformation Bactérienne. Protocole de TP . Centrifuger les tubes Eppendorf  30 secondes à vitesse maximale pour faire tomber les cellules. Le  nouveau gène introduit est appelé transgène qui peut, s’il est exprimé, conférer de nouvelles caractéristiques à la cellule. <>>> coli K12: 10 8 T-L-M+B+ et 10 8 T+L+M-B- (exigence en thréonine, T- ; leucine, L- ; méthionine, M- et biotine B-). 72°C, 1 minute, 2ème puit et suivants:  20 µl de vos échantillons. La transformation est un transfert génétique au cours duquel de l'ADN bicaténaire, libre, nu et en solution est introduit dans une bactérie réceptrice, puis intégré au chromosome. Récupérer vos tubes. Les bactéries sont gardées sur la glace et sont maintenant prêtes à l’emploi (“compétentes” pour la transformation). L’ADN ajouté se fixe sur les bactéries. La transformation de bactéries fut décrite la première fois par Griffith en 1928, puis plus tard par Avery qui démontra que l'ADN était le « principe transformant » capable de rendre des souches de Streptococcus pneumoniae virulentes. Seules les bactéries possédant le gène ampR sont capables de croître sur un milieu contenant de l’ampicilline (antibiotique de la famille des pénicillines). Distribuer ensuite les 25 µl du mélange dans les petits tubes PCR préalablement marqué sur le côté par les initiales des élèves. <> <>/ExtGState<>/ProcSet[/PDF/Text/ImageB/ImageC/ImageI] >>/MediaBox[ 0 0 595.32 841.92] /Contents 4 0 R/Group<>/Tabs/S/StructParents 0>> On note quatre fonctions principales : 1) l’éclairage, 2) l’appât, 3) la protection et 4) la communication. Thèmes: clonage moléculaire, vecteurs, hôtes, digestion, ligation, transformation bactérienne, X-gal. Visualiser la transformation de bactéries. Regarder le nombre de colonies obtenues sur chacune des boîtes et discuter des résultats, Observer les boîtes à l’obscurité et discuter de l’expérience. Préparation de bactéries compétentes : (perméabiliser la paroi bactérienne) Transformation bactérienne : (transférer un fragment d'ADN chez un organisme unicellulaire) "Miniprep" d'ADN plasmidique : (extraire l'ADN plasmidique d'une culture bactérienne) Digestion de l'ADN par les enzymes de restriction : (obtenir un mélange de fragments d'ADN) La transformation par choc thermique altère la fluidité de la membrane créant des pores: Une augmentation soudaine de la température crée des pores dans la membrane plasmique des bactéries et permet à l'ADN plasmidique de pénétrer dans la cellule bactérienne. 2 0 obj Ajouter 1 ml de LB et incuber la suspension à 37°C pendant 30 minutes (pour l'expression de la résistance à l'ampicilline). Transformation bactérienne: la méthode du choc thermique. Protocole de TP1unitéLes transferts d'ADN entre êtres vivants. %���� Protocole de transformation Pour réaliser la transformation proprement dite, réunir : 2 tubes contenant 1 mL de culture bactérienne. Les transferts d'ADN entre êtres vivants . Les cellules qui ont la capacité de prendre rapidement cet ADN sont appelées cellules compétentes. Pour que ce processus se produise, les cellules doivent être compétentes pour la transformation bactérienne. Un autre moyen de le confirmer est de mettre en évidence, par PCR, un gène qui est présent uniquement sur le plasmide. L'électroporation, appelée aussi électroperméabilisation, est une technique microbiologique qui consiste à appliquer un champ électrique sur les membranes cellulaires qui sont ainsi déstabilisées, ce qui augmente la perméabilité membranaire. Mesure de la croissance bactérienne (voir TD) L'estimation de la croissance bactérienne peut être faite par des numérations ou par des mesures de masse. IPTG Induction Protocol IPTG induction in bacteria can be performed using one of two basic methods. Prélever 1.5 ml de culture et les transférer dans 1 tube Eppendorf 1.5 ml. Protocole expérimental . Ils contiennent déjà le tampon de charge (rouge) et sont donc prêt à être mis sur gel. Quand le colorant rouge de migration arrive en bas du gel, arrêter le transformateur. Effet du milieu de régénération sur l’efficacité de transformation : 50 μl de NEB 5-alpha Competent E. coli ont été transformés avec 100 pg d’ADN de contrôle pUC19 en suivant le protocole « High Efficiency Transformation Protocol » fourni, en faisant varier le milieu de régénération. Cells that have the ability to readily take up this DNA are called competent cells. Son phénotype est modifié. Ajouter 8 µl d’ADN dans le tube marqué +. Le gène ampR code pour une enzyme (la ß-lactamase) capable d’inactiver les antibiotiques de la famille des pénicillines en clivant une liaison du noyau ß-lactame. Definition: Le transfert horizontal de gènes est un processus dans lequel un organisme intégre du matériel génètique provenant d'un autre organisme sans en être le descendant. Sélectionner les clones recombinants Insertion dans la partie LacZa de l’opéron lactose Le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D galactoside (X-Gal) est clivé par la β-galactosidase pour donner une substance En général voici ce que je fais: transformation avec le plasmide linéarisé histoire de vérifier le taux de plasmide non coupé. Il est important que les solutions et les tubes soient gardés sur glace. Déposer et étaler ces 0.1 ml sur une boite LA+Amp. endobj Thèmes: Trangénèse, plasmides, bioluminescence, sélection de bactéries, résistances aux antibiotiques, ß-lactamase, formation de colonies sur boîtes de pétri. Mettre les boîtes à 37°C pendant 24 h. Les boîtes peuvent ensuite être gardées au frigo (4°C) et incubées la nuit à 37°C juste avant de les observer en classe. Ces deux caracteristiques nous permettent de vérifier que le plasmide a bien été intégré. Trois facteurs interviennent à ce niveau : la virulence de la souche bactérienne, la sensibilité des cellules vis à vis de la bactérie, et le choix du marqueur de sélection. L’ADN sera mis dans le tube marqué +. La transformation bactérienne La transformation consiste en la conversion d’un génotype en un autre par l’introduction d’ADN exogène. transformation … 1 . Préparer le mélange dans un tube Eppendorf 1,5 ml. Celui-ci contient une origine de réplication (ori), un gène de résistance à l’antibiotique ampicilline (ampR) ainsi que l’opéron lux, (un opéron est une unité de transcription) provenant de la bactérie Vibrio harveyi. Les enzymes et substrats utilisés pour les réactions de bioluminescence sont extrêmement variés d’un organisme à l’autre. Les bactéries sont ensuite cultivées une trentaine de minutes afin de permettre l’expression du gène de résistance nouvellement incorporé. Voici un exemple de ce que l'on peut observer: Comme décrit ci-dessus, les bactéries ayant intégré le plasmide non seulement resitantes à l'ampicilline mais elle sont également capable de produire de la bioluminescence. A partir de 1600 diverses recherches permirent d’établir que cette réaction mettait en jeu une enzyme (la luciférase), un substrat oxydable (la luciférine) ainsi que l’oxygène. Si elle est exprimée, cette nouvelle information génétique peut conférer à l’organisme un nouveau caractère identifiable. x��Z͎���/���G La bioluminescence est observée dans des milliers d’espèces d’organismes vivants tels que bactéries, protozoaires, champignons, annélides, cnidaires, mollusques, insectes et poissons. II. Boîte pipettes Pasteur pour les étalements, CaCl2 (en option, pour préparation de cellules compétentes). Dans le tube déstiné au contrôle positif, ajouter 1 µl du plasmid, Recueil des 10 ans d'expériences BiOutils, Les microbes: pour le meilleur & pour le pire, Virus sans frontieres et Abécédaire de microbiologie, Prévention et Infections: Les bonnes et mauvaises piqûres. Protocole: Transformation bactérienne: 200 µL CaCl2 0,1M Choc thermique Etalement sur boite petri Kanamycine + et - Choc thermique Etalement sur boite petri Kanamycine + et - 200 µL CaCl2 0,1M 10 µl de plasmide 10µL d’eau Les stratégies de clonage: 1. Les bactéries compétentes sont d’abord gardées sur glace ce qui fige les membranes. BiOutils : support de Biologie expérimentale, Prendre une culture d’une nuit de bactéries. Historiquement, la bioluminescence est un phénomène connu depuis l’antiquité. Il s’agit d’éléments extra-chromosomiques circulaires capables de se répliquer (de 1 à 100 copies) dans la bactérie et d’être transmis dans les cellules filles lors de divisions cellulaires. Le caractère transfér… Quand la densité optique (OD600) est entre 0.5 et 0.6, mettre l'Erlenmeyer contenant les bactéries dans la glace. Pour que la transformation s'effectue, il faut que la bactérie receveuse soit en état de compétence, cet état peut-être naturel ou acquis (induit en laboratoire). Chez les bactéries, la luciférase catalyse l’oxydation de la riboflavine mononucléotide réduite (FMNH2) et une longue chaîne d’aldéhyde (R-CHO), générant une flavine oxydée (FMN), un acide gras (R-COOH), de l’eau (H2O) et de la lumière (490-500 nm). 1 tube contenant de l'eau distillée stérile; 1 tube contenant 0,5 mL de la solution de chlorure de calcium 3. Transformation of bacteria with plasmids is important not only for studies in bacteria but also because bacteria are used as the means for both storing and replicating plasmids. endobj Transformation bactérienne chimique Jour 1 1. Cet opéron contient 5 gènes, luxA à luxE. La transformation artificielle est d'un usage courant dans les laboratoires de biologie moléculaire. Il est important que les élèves puissent se rendre compte de toutes les étapes nécessaires au déroulement de l’expérience. 3 0 obj II.1. Numération totale directe Cette technique permet le dénombrement de la totalité des bactéries. 4-1- Transformation 4-2- La conjugaison ... classification des bactéries qui peut être calculé selon l'espèce bactérienne (fig.6). Afin de facilité le pipetage et pour avoir assez de matériel en cas d'erreurs, nous prévoyons un mélange pour 22 réactions. Ils codent pour les protéines impliquées dans la réaction de bioluminescence. %PDF-1.5 UNITÉ. stream 1 0 obj Référence: Journal of Visualized Experiments. Préparation de bactéries compétentes Préambule: vous pouvez éviter de mettre en oeuvre ce protocole en commandant directement à un laboratoire des bactéries compétentes.Toutefois, il est toujours judicieux de connaître l'un des procédés permettant de perméabiliser la paroi bactérienne ( … Prendre le gel et visualiser les bandes sous la lampe bleue. 94°C, 30 secondes PROTOCOLE DES MANIPULATIONS Les grandes étapes de la manipulation à réaliser en binôme Préparation des bactéries compétentes : comparaison de deux techniques; Transformation par le plasmide pGlo par choc thermique pour les deux techniques; Expression du gène de la β-lactamase ; Sélection des recombinants sur milieu + ampicilline; Because of this, nearly all plasmids (even those designed for mammalian cell expression) carry both a bacterial origin of replication and an antibiotic resistance gene for use as a … Marquer ce tube avec un -. Enfin ces bactéries sont étalées sur un milieu sélectif (permettant la croissance des cellules qui ont incorporé l’ADN). 52°C, 30 secondes Lisez ce Sciences et Technologies Dissertation et plus de 247 000 autres dissertation. Bacterial transformation is a widely used method where foreign DNA is introduced into a bacterium, which can then amplify, or clone the DNA. Cette bactérie est rendue compétente (capacité à incorporer de l’ADN) par un traitement au CaCl2. Enlever 0.7 ml de surnageant et le jeter. Si toutefois, pour des raisons techniques, il ne vous est pas possible de préparer des cellules compétentes nous pouvons vous en fournir. Pour que la Biologie reste accessible à tousSupport de Biologie expérimentale depuis 2007. J. LEDERBERG et E. TATUM en 1946 mélangèrent dans un milieu liquide, 2 mutants polyauxotrophes d'E. 4 0 obj Prélever 1.5 ml dans un autre tube Eppendorf. L’Université de Genève décline toutes responsabilités en cas de dommages survenus durant les expériences. Marquer les tubes par "pUC+" et "pUC-" respectivement. Introduction: Dans l’expérience proposée, nous allons transformer Escherichia coli. Mettre le tube marqué + et le tube marqué - sur la glace pendant 15 minutes. Mélanger en pipetant en haut en bas délicatement. Transformation bactérienne. Je n'entre pas dans le détail. Matériel nécessaire : - Kit pGLO de Transgénèse Bactérienne (Bio-Rad) : le gène de la GFP est inséré dans un plasmide conférant la résistance à l'ampicilline, et sous la dépendance d'un promoteur inductible en présence d'arabinose Les bactéries sont gardées sur la glace et sont maintenant prêtes à l'emploi ("compétentes" pour la transformation). Ces plasmides peuvent disséminer ainsi de nouvelles caractéristiques tels que des résistances aux antibiotiques, à des métaux-lourds, ou encore de rendre les bactéries virulentes. Jeter le surnageant et resuspendre le culot de cellules dans 100. 1) préparation des cellules compétentes: Le protocole présenté ici est simplifié mais permet néanmoins d’obtenir une efficacité de transformation suffisante pour l’expérience proposée. La transformation bactérienne est une méthode largement utilisée dans laquelle de l'ADN étranger est introduit à l'intérieur d'une bactérie, qui peut alors mutliplier, ou cloner l'ADN. Cette transformation peut être naturelle ou artificielle. The method that is best for you will depend on your particular protein and the application. Le rôle de la bioluminescence varie suivant ces organismes. Sortir les bactéries compétentes B834(De3) du congélateur à – 80 °C et les faire dégeler sur de la glace. Le programme dure envirn 1h30 et comporte les cycles suivants: A la fin de la réaction de PCR les tubes peuvent être gardés au congélateur, Arrêter la machine PCR en suivant les indications du, Préparer un gel à 1.5% d'agarose comme décrit dans l'expérience 10b: PCR PV92. Aristote (348-322 av JC) parlait déjà de lumière émise par des poissons morts et des moisissures. Le plasmide lux117: Pour cette expérience nous allons utiliser le plasmide lux117. TRANSFORMATION TYPE PHAGE M13 RECOMBINANT 4 ... PROTOCOLE 18 4) ... • 7 - Avant étalement, centrifuger la culture bactérienne à 3000 rpm 5 minutes et éliminer le surnageant afin de garder environ 100 µl de culture, reprendre le culot dans le surnageant. Attention, il faut pipeter, Centrifuger les tubes comme avant. Il est important que les solutions et … C'est un phénomène naturel et courant chez les bactéries. La transformation bactérienne se produit quand une cellule intègre un nouveau fragment de matériel génétique (ADN). Centrifuger les tubes comme avant. Ajouter 1 ml de CaCl2 0.05M froid sur le culot et le resuspendre en utilisant la pipette P1000. Méthodes de numération (dénombrement) II.1.1. Resuspendre le culot avec le reste (~ 0.1 ml) du surnageant. L’ADN utilisé est un plasmide. Marquer ce tube avec un +. Le phénomène a été découvert en 1928 par un médecin anglais, Frederick Griffith. Le tube marqué - servira de contrôle. Pour une classe de 16 par exemple, on compte 16 réactions plus un contrôle négatif ainsi qu'un contrôle positif, soit 18 réactions au total. Nous allons donc amplifier ici le gène de résistance à l'ampicilline (environ 860 pb), en effectuant la PCR directement sur des colonies bactériennes. Dans la nature, les plasmides peuvent être échangés entre différentes espèces de bactéries. 2. Jeter le surnageant et resuspendre le culot de cellules dans 100 µl de CaCl2 0.05M froid. <> A l'aide d'un cure-dents, prélever une colonie isolé d'une de vos boites marquée + et la resuspendre dans le mix PCR. La partie concernant la PCR a été mise en place en collaboration avec Mme Starkenmann et M. Chakhparonian, enseignants au Collège Madame De Staël. endobj Pour chaque transformation, transférer 50 µl … La réaction est la suivante : L'EXPERIENCE: (cliquer pour voir le schéma).